Трансгенными могут называться те виды растений, в которых успешно функционирует ген (или гены) пересаженные из других видов растений или животных


Прямой перенос ДНК в растительную клетку



Скачать 42.94 Kb.
страница7/8
Дата14.02.2020
Размер42.94 Kb.
Название файлаполучение трансген. раст.docx
Учебное заведениеСибирский государственный университет науки и технологий
ТипРеферат
1   2   3   4   5   6   7   8

3.1 Прямой перенос ДНК в растительную клетку

При этом способе используются различные методы: электропорация, бомбардировка, микроинъекции, воздействие полиэтиленгликоля (ПЭГ), поливинилового спирта или ионов Са, и высокого pH. Эти методы трудоемки и дорогостоящи, однако в некоторых случаях без них никак не обойтись.

В некоторых из этих методов (электропорация, воздействие ПЭГ, поливинилового спирта или ионов Са и высокого pH) в качестве объекта для введения ДНК используются протопласты – клетки, лишенные клеточной стенки. Их получают, воздействуя на растительную ткань растворенными в осмотике ферментами, разрушающими пектин и целлюлозу – пектиназой (мацерозимом) и целлюлазой. Осмотик, в качестве которого используются или многоатомные спирты (маннитол или сорбитол) или сахара (глюкоза или сахароза), необходим, чтобы протопласт после «переваривания» клеточной стенки не разрушился. После всех манипуляций протопласты высевают на питательную среду, где они образуют клеточную стенку, делятся и формируют колонии, из которых в дальнейшем могут образоваться трансформированные растения-регенеранты.

Электропорация – основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. В среду для электропорации добавляют протопласты и плазмидную ДНК, которую необходимо ввести в клетки. Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряжение 200–350 В, длительность импульса 30–60 мс), приводящие к образованию в цитоплазматической мембране, время существования и размер которых достаточны, чтобы молекулы ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. При этом объем клетки увеличивается. Напряженность электрического поля и продолжительность его действия, концентрации трансформирующей ДНК и реципиентных клеток для каждой системы клеток подбирают экспериментально, с тем, чтобы достичь высокого процента поглощения ДНК выжившими клетками. Показано, что в оптимальных условиях электропорации количество трансформантов может достигать 80% выживших клеток.

Трансформация протопластов с помощью ПЭГ, ионов Са и высокого pH. Раствор ПЭГ добавляют к суспензии протопластов, смешенных с плазмидой и инкубируют в течение 20–30 мин. При другом способе в суспензию протопластов в растворе СаСl2 добавляют щелочь, создавая pH 10–12, и выдерживают в этих условиях 15–20 мин. После таких обработок протопласты отмывают центрифугированием и высевают на питательные среды. ПЭГ и ионы Са воздействуют на плазматическую мембрану, окружающую протопласты, удаляя с неё положительный заряд, отталкивающий молекулы ДНК. На нейтрально заряженную мембрану прикрепляется плазмидная ДНК и проходит в клетку за счет пиноцитоза – формирования пузырьков, окруженных липидной мембраной, в которых находятся молекулы ДНК. В клетке липидная оболочка растворяется и ДНК встраивается в геном клетки.

Трансформация с помощью биологической баллистики (бомбардировки). Метод биологической баллистики несмотря на свою сложность, является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов (из прямых) трансформации растений, особенно однодольных растений. Суть метода заключается в том, что на мельчайшие частички инертного металла (вольфрам, титан, золото), диаметром 0,6–1,2 мкм, прикрепляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования генную конструкцию. Металлические частички, несущие ДНК, наносят на пластиковую пулю и помещают внутрь биолистической (генетической) пушки на расстоянии 10–15 см над растительной тканью-мишенью. В пушке вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В момент сбрасывания давления частички металла с огромной скоростью выбрасываются из специального отверстия, над которым помещается пуля, и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток.

Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по центру, погибают из-за огромного количества и давления металлических частиц, в то время как в зоне 0,6–1 см от центра находятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Далее клетки осторожно переносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации. Несомненным достоинством этого метода является то, что при его использовании могут быть трансформированы не только ядерные, но и органельные геномы, чего не удается осуществить другими методами.

Трансформация микроинъекцией. При этом способе каждый отдельный протопласт прикрепляют на специальную подложку и с помощью супертонкой стеклянной иглы впрыскивают в него векторную ДНК. Затем протопласты отделяют от подложки и помещают в питательную среду, где они после образования клеточной стенки могут делиться, образуя микрокаллусы, из которых в дальнейшем может регенерировать растение. Метод в настоящее время почти не используется из-за большой трудоемкости.






Поделитесь с Вашими друзьями:
1   2   3   4   5   6   7   8


База данных защищена авторским правом ©genew.ru 2020
обратиться к администрации

    Главная страница
Контрольная работа
Курсовая работа
Лабораторная работа
Рабочая программа
Методические указания
Практическая работа
Методические рекомендации
Теоретические основы
Пояснительная записка
Общая характеристика
Учебное пособие
История развития
Общие сведения
Физическая культура
Теоретические аспекты
Практическое задание
Федеральное государственное
Техническое задание
Направление подготовки
Теоретическая часть
Самостоятельная работа
Образовательная программа
Общие положения
Дипломная работа
Методическая разработка
государственное бюджетное
квалификационная работа
Выпускная квалификационная
Технологическая карта
Техническое обслуживание
Решение задач
учебная программа
Методическое пособие
История возникновения
Общие требования
Рабочая учебная
Краткая характеристика
Исследовательская работа
Общая часть
История создания
Метрология стандартизация
Основная часть
Рабочая тетрадь
Техническая эксплуатация
Название дисциплины
Современное состояние
Государственное регулирование
Внеклассное мероприятие
Организация работы
Математическое моделирование
Экономическая теория